L'extraction des protéines est une étape importante pour le Western Blot en recherche sur le cancer . Les protéines à partir d'échantillons (lignée cellulaire de cancer ) doivent être extraits de manière efficace sans dégradation. Bien que le protocole de cette technique d'extraction de protéines est très scientifique et technique , je tiens encore à part que peut-être quelqu'un qui va faire la recherche sur le cancer trouverez utile . Je vais vous expliquer la technique d'extraction protéine nucléaire et cytoplasmique .
Avant de commencer à faire l' extraction de protéines , nous devons préparer les réactifs et les équipements . Il ya 3 réactifs ( CER I , II et CER TNS) dont nous avons besoin dans l'extraction de la protéine nucléaire et cytoplasmique . Avant les réactifs peuvent être utilisés , il faut ajouter la protéase et la phosphatase cocktails d'inhibiteurs de ces trois réactifs . Les protéases et phosphatases cocktails d'inhibiteurs de fournir la solution de protection complète de l'échantillon pour protéger la protéine de dégradation lors de l'extraction . Dans ma recherche sur le cancer , j'ajoute 1:100 ratios de protéase et des cocktails d'inhibiteurs de phosphatase aux réactifs . Comme j'ai besoin de 200 pi de CER I pour chaque échantillon à extraire, je dois ajouter 2 pi de la protéase et des cocktails d'inhibiteurs de phosphatase à mélanger avec le réactif .
Maintenant nous pouvons commencer le protocole d' extraction de protéines nucléaire et cytoplasmique .
Une . Tout d'abord , nous devons tourner en baisse de 20 pi de cellules dans un tube de 1,5 ml à 500 g pendant 3 minutes. Après filage , le surnageant a été éliminé à l'aide d'une pipette .
2 . Ensuite , nous devons ajouter 200 ul de glace froide CER I du culot cellulaire . Le mélange est vortex vigoureusement pendant 15 secondes afin que la pastille est entièrement remis en suspension . Le tube est incubé sur de la glace pendant 10 minutes.
3 . Par conséquent , nous devons ajouter 11 ul de glace froide CER II et vortex à nouveau pendant 5 secondes . Ensuite , le tube est incubé sur de la glace pendant encore 1 minute et vortex pendant 5 secondes aussi.
4 . Ensuite, nous avons besoin de centrifuger le mélange . La centrifugation est un processus pour séparer le contenu dans le mélange . Après la centrifugation à 16 000 xg pendant 5 minutes , nous avons besoin de transférer le surnageant qui est l'extrait cytoplasmique à un nouveau tube de pré- refroidi. Il suffit de garder le tube sur la glace jusqu'à utilisation .
5 . Ensuite , nous avons besoin d'extraire la protéine nucléaire . Le culot est remis en suspension insoluble avec 100 pi de TNS glacée et vortex pendant 15 secondes .
6 . L'échantillon est mis sur la glace pendant 10 minutes et tourbillon pendant 15 secondes . Cette étape est répétée quatre fois pour un total de 40 minutes.
7 . Par la suite , l'échantillon est à nouveau centrifugé à 16 000 xg pendant 10 minutes . Le surnageant est extrait nucléaire qui est transférée dans un tube pré- réfrigérés propre et le maintenir sur de la glace jusqu'à utilisation. L' extraction de la protéine nucléaire et cytoplasmique pour Western Blot en recherche sur le cancer est fait.
