extraction des protéines est une étape importante pour éponger occidental dans la recherche contre le cancer. Les protéines à partir d'échantillons (lignée de cellules cancéreuses) doivent être extraites de manière efficace, sans dégradation. Bien que le protocole de cette technique d'extraction des protéines est tout à fait scientifique et technique, je veux encore faire part que peut-être quelqu'un qui va faire la recherche sur le cancer sera utile. Je vais vous expliquer la technique de la protéine nucléaire et cytoplasmique extraction.
Avant de commencer à faire l'extraction des protéines, nous avons besoin de préparer les réactifs et les équipements. Il ya 3 réactifs (CER I, II et CER TNS) que nous avons besoin dans l'extraction des protéines nucléaires et cytoplasmiques. Avant les réactifs peuvent être utilisés, il faut ajouter cocktails inhibiteur de la protéase et la phosphatase de ces 3 réactifs. Les cocktails inhibiteur de la protéase et la phosphatase fournir la solution avec la protection de l'échantillon complet pour protéger les protéines de la dégradation lors de l'extraction. Dans ma recherche sur le cancer, je ajouter 1:100 ratios de la protéase et des cocktails inhibiteur de la phosphatase des réactifs. Comme je l'ai besoin de 200 pi de CER I pour chaque échantillon à extraire, je dois ajouter 2 pi de cocktails inhibiteur de la protéase et la phosphatase à mélanger avec le réactif.
Maintenant nous pouvons commencer le protocole d'extraction des protéines nucléaires et cytoplasmiques.
1. Tout d'abord, nous avons à tourner en baisse de 20 ul de cellules dans un tube de 1,5 ml à 500 xg pendant 3 minutes. Après la filature, le surnageant a été éliminé à l'aide d'une pipette.
2. Ensuite, il faut ajouter 200 ul de CER glacée I du culot cellulaire. Le mélange est vortex vigoureusement pendant 15 secondes pour que la pastille est entièrement remis en suspension. Le tube est incubé sur la glace pendant 10 minutes.
3. Par conséquent, nous devons ajouter 11 ul de la glace froide CER II et vortex pendant 5 secondes. Ensuite, le tube est incubé sur la glace à nouveau pendant 1 minutes et vortex pendant 5 secondes trop.
4. Ensuite, nous avons besoin de centrifuger le mélange. La centrifugation est le processus de séparer le contenu dans le mélange. Après la centrifugation à 16.000 g pendant 5 minutes, nous avons besoin de transférer le surnageant qui est l'extrait cytoplasmique dans un nouveau tube pré-réfrigérés. Il suffit de garder le tube sur la glace jusqu'à utilisation.
5. Ensuite, nous avons besoin pour extraire les protéines nucléaires. Le culot insoluble est remis en suspension avec 100 pi de TNS glacée et vortex pendant 15 secondes.
6. L'échantillon est mis sur la glace pendant 10 minutes et tourbillon pendant 15 secondes. Cette étape est répétée 4 fois pour un total de 40 minutes.
7. Plus tard, l'échantillon est centrifugé à nouveau à 16.000 g pendant 10 minutes. Le surnageant qui est extrait nucléaire est transféré dans un tube propre pré-réfrigérés et le conserver sur la glace jusqu'à utilisation. L'extraction de la protéine nucléaire et cytoplasmique pour éponger occidental en recherche sur le cancer est fait.
Après l'extraction des protéines, nous devons continuer avec la quantification de la concentration de protéines à l'aide de méthode de Bradford avant que nous puissions procéder à la SDS-PAGE.
